大腸桿菌菌體蛋白殘留（E.coli DH-5α）酶聯免疫分析（ELISA）
試劑盒使用說明書
本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于測定血清，血漿及相關液體樣本中大腸桿菌菌體蛋白殘留（E.coli DH-5α）的含量。
實驗原理：
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中大腸桿菌菌體蛋白殘留（E.coli DH-5α）水平。用純化的大腸桿菌菌體蛋白殘留（E.coli DH-5α）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入大腸桿菌菌體蛋白殘留（E.coli DH-5α），再與HRP標記的大腸桿菌菌體蛋白殘留（E.coli DH-5α）抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的大腸桿菌菌體蛋白殘留（E.coli DH-5α）呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中大腸桿菌菌體蛋白殘留（E.coli DH-5α）濃度。
試劑盒組成：
試劑盒組成 | 48孔配置 | 96孔配置 | 保存 |
說明書 | 1份 | 1份 |
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封板膜 | 2片（48） | 2片（96） |
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密封袋 | 1個 | 1個 |
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酶標包被板 | 1×48 | 1×96 | 2-8℃保存 |
標準品：27ng/L | 0.5ml×1瓶 | 0.5ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
標準品稀釋液 | 1.5ml×1瓶 | 1.5ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
酶標試劑 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
樣品稀釋液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
顯色劑A液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
顯色劑B液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
終止液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
濃縮洗滌液 | （20ml×20倍）×1瓶 | （20ml×30倍）×1瓶 | 2-8℃保存 |
樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上 清，保存過程中如出現沉淀，應再次離心。
2. 血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分 鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。
3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中 如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4. 細胞培養上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/ 分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃 度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右 （2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備 用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將 標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢 測，其余冷凍備用。
6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進 行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.
7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟
1.標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔10孔，在、第二孔中分別加標準品 100μl，然后在、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻；然后從孔、第二孔中各取 100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻；然后 在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、 第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第 七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分 別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第九 第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為18ng/L，12ng/L ， 6ng/L，3ng/L， 1.5ng/L）。
2.加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品 孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品 終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
4.配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用。
5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5 次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
7.溫育：操作同3。
8.洗滌：操作同5。
9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分 鐘.
10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
11.測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后 15分鐘以內進行。
注意事項：
1.試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用 完，板條應裝入密封袋中保存。
2.濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
3.各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制 在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
4.請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大標 準品孔孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）后再測定，計算時請 后乘以總稀釋倍數（×n×5）。
5.封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6.底物請避光保存。
7.嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
8.所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9.本試劑不同批號組分不得混用。
10.如與英文說明書有異，以英文說明書為準。
計算：
以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，
在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD
值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋
倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標
準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值
代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋
倍數，即為樣品的實際濃度。
（此圖僅供參考）
試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.95以上。
2.批內與批間應分別小于9%和11%
檢測范圍：
0.7ng/L -20ng/L
保存條件及有效期：
1.試劑盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6個月
